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综述:肿瘤中糖蛋白糖链结构与功能变化的研究进展
Alteration of Glycan Structure and Glycoprotein Function in Cancer
江凯 张舒 刘银坤
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作者单位:复旦大学附属中山医院肝癌研究所
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中文摘要:在多种多样的蛋白质翻译后加工中,糖基化修饰是最普遍的一种,约50%的蛋白质是糖基化修饰的[1]。如果把O连接的葡萄糖胺修饰的细胞核内蛋白和胞质蛋白包括进来,其比例会更多[2];尤其是那些涉及细胞与细胞相互作用的许多分子,它们都是糖蛋白。糖蛋白糖链参与诸如细胞生长、细胞黏附、肿瘤转移等许多重要的生理和病理过程[3]。以糖蛋白N-糖链为例,分支结构可从蛋白表面伸出>3 nm的大型的具有分支的可移动糖簇结构,足够长的糖簇结构可形成必须的独立结构域,从而发挥重要功能[4]。

正如蛋白质结构的变化直接影响其功能一样,糖链结构的多样化形成了糖蛋白功能的多样化,糖链结构的细微变化同样会引起功能的不同,在肿瘤中体现尤为明显。近年来,糖链功能的研究备受关注,但糖链结构固有的复杂性和分析工具的缺乏已经成为该研究领域的瓶颈[5]。蛋白质组学,尤其是糖蛋白质组学和糖组学的技术发展,已使糖链和糖蛋白的定量成为可能[6]。蛋白质组学正逐渐与肿瘤生物标记物的选择和肿瘤侵袭转移研究相结合,推动生物医学的发展和临床转化[7]。

1 糖蛋白糖链的分类

根据肽链上的连接位点, 糖链主要分为天冬酰胺(Asn)连接的N连接型糖链和丝氨酸或苏氨酸(Ser /Thr)连接的O连接型糖链2大类。N连接型糖链均具有共同的五糖核心, 根据其组成的不同分为高甘露糖型、复杂型和杂合型3种类型[4]。O连接型糖链也可延伸为多种不同核心结构的类型[8]。与蛋白质相连糖链不同导致糖蛋白所执行的功能或者在机体内所具有的活性也有所不同。

2 肿瘤中糖蛋白糖链结构的变化

糖链在刺激肿瘤细胞迅速增殖、介导肿瘤细胞的黏附和侵袭方面起重要作用。在肿瘤细胞中糖蛋白和糖链变化有多种形式:特定结构的糖链表达量差异、不完整糖链结构的出现、糖前体的聚集、新糖链结构的出现等[9]。其中,分支糖链结构(平分型N乙酰葡萄糖胺、β-(1-6)-N乙酰葡萄糖胺和核心岩藻糖等)与黏附分子介导的许多生物学功能密切相关,包括细胞黏附和肿瘤转移[10]。在高转移性的细胞系中,β-(1-6)-N乙酰葡萄糖胺水平显著上升[11]。

在肿瘤中多种特定糖蛋白糖链普遍出现,如异常的糖链分支结构、唾液酸修饰的糖链、唾液酸的Lewis(sLeX)修饰糖链等,糖复合物的选凝素特异识别谱型也会随之变化。选凝素通过与肿瘤细胞上的糖复合物结合可介导肿瘤的转移,糖链藉此与肿瘤的转移相关[12]。目前研究[13] 也证实糖链变化有利于癌症标记物的筛选,以糖链为靶点来抑制肿瘤转移可为肿瘤治疗提供新方法。肿瘤糖蛋白糖链变化应用于临床有十分广阔的前景[14]。

糖链变化有其肿瘤特异性,几乎每种恶性肿瘤都有各自特征性的糖链变化:(1)在肝癌中,岩藻糖基化修饰增加,3天线糖链增加,平分型N乙酰葡糖胺修饰增加[15];(2)在肺癌中,岩藻糖基化修饰增加,单天线、3天线、4天线糖链增加,糖链的唾液酸化程度增加,唾液酸的Lewis X修饰增加[16];(3)在胃癌中,N-乙酰氨基乳糖修饰增加[17];(4)在胰腺癌中,唾液酸的Lewis X修饰增加(主要在应激蛋白中)、岩藻糖基化修饰增加[18];(5)在乳腺癌中,2、3、4天线糖链增加,唾液酸的Lewis X修饰增加[19];(6)在黑素瘤中,岩藻糖基化修饰增加,糖链的唾液酸化程度增加[20]。糖蛋白糖链结构变化与疾病的联系日益受到重视,糖链结构变化对糖蛋白功能的影响在肿瘤中的作用也逐渐明了。

3 肿瘤细胞中糖蛋白糖链及其功能的研究

无论是对单个蛋白还是对整个细胞,糖链都起着至关重要的作用。糖链最普遍的一项功能是调节多种配体与受体的相互作用。分泌蛋白上的糖链在蛋白的分泌过程中还可以调节蛋白质的质量,控制蛋白质在膜上的翻转和细胞器之间的穿梭[1]。

3.1 整联蛋白 整联蛋白是一类由α亚基和β亚基构成的细胞外基质的跨膜受体。整联蛋白的作用主要是调节细胞黏附,并且参与诸多细胞信号通路以调节组织修复、细胞生长、细胞分化和细胞凋亡[21]。寡糖链可以调节整联蛋白的活性状态。肿瘤细胞的形成和其黏附能力会随着整联蛋白α5β1的N-糖链改变而改变。将Ras基因导入NIH3T3细胞中,细胞与纤连蛋白的结合力明显上升,此现象是由α5β1的3天线和4天线分支中β-(1-6)-GlcNAc比例上升所致。整联蛋白α3β1也存在类似现象,在转移的人黑素瘤细胞中β-(1-6)-GlcNAc修饰比例显著上升,此修饰导致肿瘤的侵袭和转移。可见整联蛋白糖基化修饰的改变可以使肿瘤细胞黏附力也随之改变[22]。

研究[23]发现B16黑色素瘤细胞中乙酰氨基葡萄糖基转移酶GnT-III的过表达可以抑制由α5β1特异受体纤连蛋白介导的肿瘤细胞的分布和转移,同时可检测到被平分型GlcNAc修饰过的α5β1对纤连蛋白的亲和力显著下降。整联蛋白介导的信号通路的激活依赖于其糖基化修饰完整性和多样性,整联蛋白任一糖链的改变都有可能影响肿瘤细胞的表型而发生不可逆的恶变。

3.2 E钙黏蛋白 E钙黏蛋白是一种分子量为120 kDa的I型膜蛋白,是依赖于钙离子的细胞黏附分子家族的一员。E钙黏蛋白分子有5个潜在的糖基化位点,定点突变单一糖基化位点的质粒转染实验(MDA-MB-435高侵袭性的乳腺癌细胞)证实Asn634位点上的N糖链对其蛋白的稳定性至关重要,此位点糖链的去除将引发E钙黏蛋白的泛素化降解;Asn372、Asn554、Asn566和Asn619位点的糖链不影响其稳定性及向细胞表面的运输,但对其在细胞表面的分布有影响[24]。

糖基化修饰的类型对细胞功能有重大影响,同时也说明E钙黏蛋白的平分型GlcNAc的增多可以阻止肿瘤细胞的迁移,可能有潜在的临床应用价值,可以为防治肿瘤的转移、复发提供新的思路。

3.3 触珠蛋白 人触珠蛋白是一种应激蛋白,由肝脏分泌生成。触珠蛋白由2个亚基组成,每个亚基由1条α链和1条β链组成,由二硫键将2条链连接起来[25]。触珠蛋白的β链有4个潜在的N糖基化位点:Asn184、Asn207、Asn211和Asn241。胰腺癌患者血清蛋白的杨树菇(Agrocybe aegerita)半乳糖凝集素AAL凝集素印迹实验可检测到高度岩藻糖基化的触珠蛋白β链,触珠蛋白的岩藻糖基化检出率为60%~80%,并且随着病情的严重而增大。其Asn211位点岩藻糖基化水平比其他位点都要低。20%~40%的恶性肿瘤,如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、肝癌可以检测到触珠蛋白的岩藻糖基化水平的上升。由于触珠蛋白在清除血红蛋白方面起重要作用,恶性肿瘤状态下检测到的岩藻糖基化水平的改变则可调节触珠蛋白这方面的功能[25]。目前,对在癌症发生时触珠蛋白β链N糖链的研究已成为热点,需要更多深入的研究来阐释其在恶性肿瘤中变化的机制。

3.4 其他典型糖蛋白的研究 与肿瘤发生相关的糖蛋白还有很多,表皮生长因子受体(EGFR)的N糖链核心岩藻糖基化的缺失会使表皮生长因子(EGF)诱导的EGFR磷酸化水平显著下降,下游信号通路,如Erk和JNK的激活也受到显著抑制;而在HeLaS3细胞中研究发现平分型GlcNAc对EGFR介导的信号通路具有促进作用。CD44是一种细胞表面糖蛋白,在卵巢癌细胞和黑素瘤细胞中的研究[26]证实CD44的N糖链修饰的抑制或突变会降低透明质酸与其结合。转化生长因子β(TGFβ)受体核心岩藻糖基化影响其活性,在无岩藻糖基化的TGFβ受体,其活性显著下降。

4 展望

近年来,糖生物学在肿瘤中的重要性受到越来越多的关注。糖生物学逐渐向糖链结构的解析及其在疾病中的作用等方向转变。用于解析结构的方法也已取得相当进展,许多高分辨率和高亲和力的方法,如毛细管电泳(CE)、高效液相层析(HPLC)、质谱等已逐渐应用于糖组学的研究。目前,糖生物学功能的研究主要通过定点突变构建单一糖基化位点敲除的质粒再转染入肿瘤细胞系(一般为缺失某一特定糖蛋白的细胞系),观察这些不同糖基化位点缺失的糖蛋白功能有何变化,以此确定糖链对糖蛋白功能的影响;另外,还可以在细胞系中过表达特定糖基转移酶或应用糖基转移酶的抑制剂,产生特定糖链结构的糖蛋白,证实特定糖链结构对糖蛋白功能的重要性。但这些方法有各自的局限性,因为糖的研究不像蛋白质那样可通过基因的改变来直接改变结构,而是需间接改变加工特异糖链的糖基转移酶,如此,可能会影响非目的糖链的加工而造成结果不准确。如何做到一步到位的改变目的糖蛋白的糖链还有待进一步探索。

正如氨基酸的连接顺序作为蛋白质的一级结构一样,糖链的单糖连接顺序也是其“一级结构”。糖链的“一级结构”不会像蛋白质那样容易检测,且其在基因上也找不到相应的“密码”。但是,为何糖链的加工却可以很保守地进行,这个问题的解决可以更好地解释糖链的功能和其结构基础,从而使它们在肿瘤中的作用更加明确。

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