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综述:SIRT1对糖尿病大血管病变的改善作用研究进展
Protective Effect of SIRT1 on Macrovascular Disease in Diabetes
许琼 高鑫
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作者单位:复旦大学附属中山医院内分泌科
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糖尿病血管病变是糖尿病患者病死的主要原因。糖尿病患者发生冠状动脉粥样硬化、周围血管病变和脑卒中的发生风险增加。糖尿病心血管病变最主要的特点是早期、广泛形成动脉粥样硬化[1]。内皮细胞功能紊乱是动脉粥样硬化形成最为重要的早期步骤,其主要表现为内皮源性的舒张因子一氧化氮(nitric oxide,NO)的合成和利用减少,出现由NO介导的内皮依赖的血管舒张功能降低以及淋巴细胞黏附、血小板活化聚集功能的抑制等抗动脉粥样硬化作用的减弱[2]。因此,改善内皮细胞功能紊乱是预防糖尿病血管病变发生、发展的关键。Sirt2(Sirtuins 2)是在低等生物中发现参与调节限热卡饮食(calorie restriction,CR)的重要蛋白[3]。SIRT1是在哺乳动物中的Sirt2类似物,目前其对糖尿病血管病变的保护作用已得到广泛研究。SIRT1可以通过对其底物的去乙酰化作用,改善内皮细胞的胰岛素抵抗、氧化应激状态以及内皮细胞所处的微环境,从而发挥减轻内皮细胞功能紊乱、阻碍动脉粥样硬化发生发展的作用,SIRT1有可能成为治疗糖尿病大血管病变的潜在靶点。

1 内皮细胞的功能

内皮细胞不仅是血管的机械保护屏障,而且还能通过分泌多种生物活性物质维持血管的稳态平衡,发挥抗血小板聚集、抗凝、维持血管正常舒缩功能的作用。内皮细胞分泌的生物活性物质包括内皮源性的舒张因子和内皮源性的收缩因子。内皮源性的舒张因子主要包括NO、前列腺素和缓激肽,发挥抑制血小板聚集、舒张血管的作用;内皮源性的收缩因子包括内皮素、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)、血栓烷A2、血管紧张素Ⅱ,引起致炎、促进氧化应激、促进血管平滑肌细胞增殖和血管收缩的作用。

NO是内皮细胞分泌的主要具有舒张血管活性作用的物质。NO由内皮细胞中的NO合成酶(endothelial NO synthase, eNOS) 作用于L 精氨酸生成。在生理状态下,内皮细胞合成并分泌NO后,扩散至周边的组织和细胞,通过舒张平滑肌细胞和抑制淋巴细胞的黏附和迁徙、骨骼肌细胞增殖、血小板的黏附聚集、黏附分子的释放发挥心血管的保护作用[2]。在糖尿病患者中,高葡萄糖、高脂、胰岛素抵抗通过炎症、氧化应激、细胞凋亡等机制导致内皮细胞功能紊乱,主要表现在内皮细胞中NO生物利用率的下降。

2 SIRT1促进NO生成的机制

2.1 SIRT1的去乙酰化作用

SIRT1位于哺乳动物细胞核的核浆内,其绝大部分的生物功能都依赖于它的去乙酰化作用。SIRT1去乙酰化作用的底物包括多种在代谢过程中起关键作用的转录因子和协同因子:eNOS、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子 1α(peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α,PGC 1α)、p53、FOXO家族成员等,通过对这些因子的作用促进内皮细胞中NO的生成、改善细胞内的氧化应激状态以及调节细胞的能量代谢过程。

2.2 SIRT1促进NO生成的机制

2.2.1 SIRT1上调eNOS的表达 SIRT1可以通过上调eNOS的表达促进NO生成。研究[4]表明低热卡饮食能导致SIRT1和eNOS的表达上调。在小鼠内皮细胞中特异性的过表达SIRT1后,eNOS表达上调[5]。在人冠状动脉内皮细胞的研究[6]中,SIRT1的活化剂白藜芦醇(resveratrol, RSV)呈剂量依赖性的诱导eNOS表达;而用小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰SIRT1的表达后,RSV促进SIRT1表达上调的作用消失。

2.2.2 SIRT1促进eNOS磷酸化

eNOS的蛋白结构上存在多个丝/苏氨酸残基磷酸化位点,因此其活性受多种激酶和磷酸酶的调节。其中eNOS的1177位点是研究最为广泛的磷酸化调节位点,而此位点最常见的调节激酶是蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)。在NAD生物合成酶脂肪素的研究[7]中发现,脂肪素能通过酪氨酸激酶介导的Akt激活,磷酸化eNOS的1 177位点,增强eNOS的活性,提示SIRT1可能依赖于细胞内NAD水平促进eNOS的磷酸化。此结论也在Orima等人的研究中得到证实[8 9]。

2.2.3 SIRT1促进eNOS 496和506位点的去乙酰化

SIRT1能对eNOS发挥去乙酰化作用,增加eNOS的活性、促进NO的合成。Mattagajasingh等[10]研究发现 SIRT1可以去乙酰化eNOS 496和506位点的赖氨酸残基,增加eNOS的活性;而用SIRT1抑制剂抑制SIRT1的活性后,内皮依赖的舒张功能和NO的生物利用率减少。

3 SIRT1改善糖尿病引起的内皮细胞功能紊乱

糖尿病状态下内皮细胞功能紊乱的发生与内皮细胞出现胰岛素抵抗、老化、氧化应激、糖脂毒性等相关。SIRT1可以通过改善以上几个方面改善内皮细胞功能紊乱。

3.1 改善内皮细胞的胰岛素抵抗

胰岛素通过胰岛素受体或非受体型酪氨酸激酶家族(Src)介导的2条平行信号通路调节内皮细胞功能。这2条信号通路分别是胰岛素受体底物 1/磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B(IRS 1/PI3 K/Akt)和Ras/Raf/MAP激酶通路。Akt 激酶活化后能磷酸化eNOS 1 177位点,促进内皮细胞中NO生成,导致血管舒张;Src通路的磷酸化增加细胞内内皮素 1(endothelin,ET 1)的表达,导致血管收缩。胰岛素抵抗时内皮细胞对胰岛素的敏感性降低,出现这2条信号通路的转导不平衡:Akt激酶介导的信号通路转导降低, eNOS活化程度和NO生成减少,但Src信号通路没有变化,最终引起内皮细胞功能紊乱。Yang等[11]研究发现高葡萄糖孵育人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC) 48 h后,胰岛素诱导的内皮细胞NO释放明显减少,出现胰岛素抵抗;但在用RSV预先处理后,胰岛素诱导的内皮细胞中eNOS表达水平上调、ET 1表达水平下调,NO的合成增多;而RSV的此种作用在加入SIRT1的siRNA干扰SIRT1的表达后减弱,说明RSV可以通过对SIRT1的作用,改善高葡萄糖诱导的内皮细胞胰岛素抵抗。

3.2 延缓内皮细胞的老化

糖尿病是与机体衰老相关的疾病。机体衰老在细胞水平上表现为细胞分裂障碍,出现相关基因表达、细胞形态学和功能的变化,称为细胞老化。老化内皮细胞的主要特点是NO生成减少、细胞内eNOS表达和磷酸化水平变化、纤溶酶原激活物抑制剂 1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI 1)增加[12]。糖尿病相关的内皮细胞老化与高葡萄糖引起的NO减少、端粒缩短、DNA的氧化损伤相关[12]。研究[13]发现高葡萄糖水平诱导HUVEC72 h后,细胞内老化相关的β 牛乳糖(senescence associated β galactosidase,SA β gal)水平增加、人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)活性降低;但孵育促进NO生成的物质:L 精氨酸(L arginine), L 瓜氨酸(L citrulline)或抗氧化应激药物后,高葡萄糖诱导的HUVEC老化得到改善,说明促进NO的生成能缓解内皮细胞的老化。

内皮细胞中SIRT1的表达上调可以增加eNOS表达,改善氧化应激诱导的内皮细胞老化。Ota等[14]研究发现,用SIRT1阻断剂sirtinol抑制SIRT1的活性或用SIRT1的siRNA干扰SIRT1的表达后,可以导致HUVEC出现老化:表现为SA β gal活性增加,细胞生长停止、体积增大、形态扁平;同时eNOS的表达和活性减少、PAI 1的表达增加。相反,SIRT1的过表达可以改善双氧水诱导的SA β gal活性增加、细胞形态学改变以及eNOS、PAI 1表达的变化,说明SIRT1可以改善氧化应激诱导的HUVEC早老化和eNOS表达的变化。SIRT1改善氧化应激诱导的内皮细胞老化的作用也在Kao等[15]的研究中得到证实。

对SIRT1的活化剂RSV的研究[8]表明RSV可以改善高葡萄糖诱导的内皮细胞功能紊乱,用高葡萄糖(22 mmol/L)诱导HUVEC 160 d后,SIRT1的表达与对照组相比显著下调,伴随着p53的下调;但是过表达SIRT1后,高葡萄糖阻碍内皮细胞分裂、诱导内皮细胞老化的作用明显减弱。在此研究中同时发现用链脲霉素(streptozocin,STZ)诱导的糖尿病小鼠中主动脉内皮细胞的老化明显、SIRT1的表达下调;但给予SIRT1活化剂RSV治疗后,糖尿病小鼠主动脉内皮细胞的老化以及eNOS的表达水平得到改善,表明SIRT1在高葡萄糖诱导的内皮细胞老化中起重要作用。

3.3 改善内皮细胞的氧化应激损伤

在糖尿病患者中,高葡萄糖、高脂以及胰岛素抵抗引起的血管内皮细胞中ROS增多是内皮细胞功能损伤的主要机制[16]。在高能量代谢的环境中,线粒体是细胞内ROS的主要来源,它可以通过对NO合成酶解耦联的间接作用或与NO的直接相互作用,导致NO的合成和利用减少,引起内皮细胞功能紊乱[17]。线粒体的生物合成即线粒体呼吸链复合体的合成,由PGC 1α、β以及下游的核呼吸因子 1(nuclear respiratory factor,NRF 1)共同参与调节。通过上调PGC 1α、NRF 1的表达,促进线粒体的生物合成、提高线粒体功能,对改善氧化应激诱导的内皮细胞功能损伤有重要作用。SIRT1可以通过对PGC 1α的去乙酰化作用活化PGC 1α,经下游的线粒体生物合成通路,改善细胞内的氧化应激状态和内皮细胞功能。研究[6]发现,RSV能活化SIRT1,增加eNOS的表达,同时上调PGC 1α信号通路水平,从而促进线粒体生成和提高线粒体复合酶体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的表达水平,最终改善细胞内的氧化应激状态。SIRT1也可以作用于内皮细胞中其它与氧化应激状态相关的酶和蛋白,改善高葡萄糖诱导的细胞氧化应激损伤[18]。

3.4 减轻内皮细胞的凋亡

糖尿病环境下内皮细胞中的ROS增多可以导致细胞凋亡,进一步影响内皮细胞的功能。SIRT1可以减轻内皮细胞的凋亡,改善内皮细胞功能。Zhang等[5]研究发现SIRT1的过表达可以明显减轻氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)诱导的HUVEC凋亡,促进eNOS的表达,但用SIRT1抑制剂NAM抑制SIRT1活性或用SIRT1的siRNA抑制SIRT1的表达后,SIRT1促进eNOS表达的作用消失,同时SIRT1减轻HUVEC凋亡的功能也降低。

3.5 改善内皮细胞的高血糖环境

SIRT1能促进葡萄糖诱导的β细胞胰岛素分泌。在β细胞内特异性过表达SIRT1的转基因小鼠 (beta cell specific SIRT1 overexpressing transgenic mice,BESTO)研究[19]中发现β细胞内SIRT1表达水平的增加能提高葡萄糖耐量和葡萄糖刺激的胰岛素分泌;同时离体胰腺灌流实验证明SIRT1可以促进葡萄糖和氯化钾诱导的β细胞胰岛素分泌,进一步用微阵列芯片分析β细胞系内SIRT1调节的靶基因,结果发现这些靶基因主要包括解偶联蛋白2 (uncoupling protein 2,UCP2)在内的多种与胰岛素分泌相关的基因;另外,Bordone等[20]研究也证实SIRT1能通过下调UCP2的表达参与β细胞的胰岛素分泌过程。

肌肉组织是参与餐后葡萄糖摄取的主要器官。缓解肌肉组织的胰岛素抵抗、促进肌肉组织的葡萄糖摄取能改善2型糖尿病患者的餐后血糖升高。骨骼肌的线粒体功能失调在胰岛素抵抗的发生、发展中有重要地位[21],增加参与线粒体生物合成的PGC 1α及下游的核呼吸因子的表达,对提高线粒体功能,改善胰岛素抵抗有重要作用。在骨骼肌细胞的研究[22]中发现,饥饿和低糖可以诱导的SIRT1表达增加和去乙酰化PGC 1α水平提高,进而通过PGC 1α的下游信号通路活化线粒体脂肪酸氧化所需要的基因,促进线粒体生成,进而改善骨骼肌胰岛素抵抗。

4 SIRT1的活化剂治疗糖尿病大血管病变的前景

RSV是研究最为广泛的SIRT1活化剂,能通过与SIRT1的变构相互作用,使SIRT1和NAD+以及去乙酰化底物之间的亲和力增加,从而增加SIRT1的去乙酰化作用。研究[23]发现RSV能改善高脂饮食诱导的小鼠肥胖和胰岛素抵抗;用RSV喂养17个月后的低热卡饮食老年小鼠(27个月)能明显改善衰老的病理学特点包括血管内皮的凋亡减少、动脉弹性增加等。RSV在低热卡饮食的小鼠中有延长寿命的作用[24]。SIRT1活化剂还包括SRT1460、SRT1720 和SRT2183,其活化机制是通过降低SIRT1和底物之间酶促反应的米氏常数,增加SIRT1对底物的去乙酰化作用,它们在结构上与RSV完全不同,但比RSV作用更强;这些活化剂能提高饮食诱导的肥胖小鼠以及遗传性肥胖小鼠中的胰岛素敏感性,降低血浆葡萄糖水平和提高线粒体的氧化磷酸化水平,并且在Zucker fa/fa糖尿病肥胖大鼠模型中,SIRT1活化剂可以提高整体的葡萄糖稳态以及脂肪组织、肝脏组织和骨骼肌的胰岛素敏感性[25]。因此,SIRT1的活化剂将有望成为治疗糖尿病大血管病变的新型药物。

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