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综述:流式细胞术在原发性免疫缺陷病诊断中的应用
Flow Cytometric in the Diagnosis Primary Immunodeficiency Diseases
陈冉 白丽
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作者单位:大理学院医学微生物学及免疫学教研室
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原发性免疫缺陷病(primary immunodeficiency disease,PID)是由遗传因素或先天性免疫系统发育不良造成免疫功能障碍引起的疾病。患者表现为免疫细胞发育、分化、增生、调节和代谢异常,并导致机体免疫功能降低或缺陷。目前,随着分子遗传学和免疫学的进步,越来越多人类PID被发现和鉴定, 迄今为止已发现160多种PID[1],其中100多种已经有明确的分子遗传学基础[2]。PID病率各国报道不一,澳大利亚约为5.6/10万[3],伊朗西北部土耳其种族约为24/10万[4],美国是1/1 200[5],我国目前缺乏这方面的统计数据。各类PID的发生比率在不同国家和地区的调查结果有较大差距, 但是主要抗体缺陷在PID发生中所占的比率高于50%[6]。

世界卫生组织(WHO)与国际免疫协会(IUIS)联合组织专家,每2年召开会议更新PID命名和分类。最近一次会议形成了以下8组分类[7]:(1)抗体缺陷;(2)吞噬细胞缺陷;(3)其他明确的免疫缺陷综合征;(4)联合免疫缺陷;(5)免疫失调性疾病;(6)自身炎性反应性疾病;(7)天然免疫缺陷;(8)补体缺陷。随着基础免疫学不断发展, PID所包含的疾病数量会不断增长。

随着流式细胞术(FCM)的发展,对单个细胞上成分检测成为现实,这与以往的基因序列分析检测手段相比,FCM是一种快速、灵敏、重复性好的分析方法,可以评价一个细胞类型的几个特性:计算细胞类型、棚架功能、检测特定的基因产物,已愈来愈成为临床常规的检测项目。因此,FCM在PID的诊断中起着重要的作用[8]。

1 抗体(B细胞)免疫缺陷病

此病由于B细胞发育缺陷或B细胞对T细胞传递的信号反应低下所致的抗体生成障碍,以体内Ig水平降低或缺失为主要特征。这种异常可发生在B细胞发育的各个阶段,也可发生在成熟B细胞对抗原刺激应答的各个阶段。

1.1 X连锁无丙种球蛋白血症(X-linked agammaglobulinemia, XLA)

XLA即先天性无丙种球蛋白血症,又称Bruton综合征。此病是最常见的原发性B细胞免疫缺陷病,见于男性婴幼儿,其特点是血循环中B细胞及各类Ig减少或缺失,临床表现为从婴儿期起即发生反复化脓性感染。XLA患者临床过程差异大,大部分患者诊断年龄<5岁,也有少数患者由于临床表现轻,直至成年后才得到诊断[9]。

XLA是一种X连锁隐性遗传病,引起该病的基因定位于X染色体上(Xq21.3-22),若该基因突变或缺失,可致酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase, Btk )合成障碍,使B细胞发育、成熟障碍。应用FCM分析结果显示患者外周血B细胞减少或消失,表面表达免疫球蛋白的成熟B细胞消失;T细胞计数常正常,但是CD4+CD8+T细胞可以正常或降低,而CD4+T细胞常高表达,CD45RA分子提示以幼稚型T细胞为主,T细胞可能存在分化障碍;骨髓中仅有少量CD19+CD10+B细胞或CD19+CD10-B细胞[10]。Futani等[11]用Btk单抗进行了FCM分析,发现该类患者的血小板Btk表达也缺失,并且携带者存在着2群血小板,一群表达Btk,而另一群不表达Btk。

1.2 普通易变型免疫缺陷病(common variable immunodeficiency, CVID)

CVID是一组以B细胞成熟和抗体形成缺陷为主要特征的疾病。患者体内存在B细胞成熟过程,但是免疫球蛋白水平(IgA、IgG、IgM)降低,T细胞和B细胞均存在缺陷。该病不具有特定的流式特征,同时流式表型会随着患者年龄的增长而发生改变[12]。CVID的实验室检查特征为外周血IgG、IgA、IgM含量均降低,而B细胞和T细胞数量正常,但有1/3的CVID病例T细胞亚群出现异常[13], 表现为CD8+T细胞升高,CD4/CD8 T细胞比例下降。另外,Bunk等[14]应用诱导型T细胞共刺激因子(inducible T cell costimulator)单抗检测活化的T细胞,结果发现在部分CVID患者该因子表达为阴性。近年来发现穿膜蛋白活化物(TACI)、可诱导共刺激分子及CD19的突变都可导致CVID[15]。

1.3 选择性IgA缺乏症(selective IgA deficiency)

选择性IgA缺乏症是免疫缺陷病中最常见的类型。FCM对此病的诊断意义不大。单独IgA缺陷患者B细胞和T细胞数都正常。在IgA缺陷患者中,超过80%的IgA阳性细胞共表达IgM和IgD,这说明成熟受阻。

2 T细胞免疫缺陷病

先天性胸腺发育不良综合征,又称Di-George综合征,为典型的T细胞缺陷性疾病并伴甲状腺功能低下。其主要临床特征有心脏和大血管畸形、反复感染和新生儿24 h内出现手足抽搐。实验室检查表现为T细胞功能缺陷,外周血T细胞数量减少或正常。FCM分析结果显示患者的外周血CD3+、CD4+ 和CD8+ T细胞均减少,在残余T细胞中,T细胞受体(TCR) αβ分子表达减少,γδ分子表达正常,CD4+/CD8+T细胞比例升高。随受累者年龄的增加CD8+细胞数增多,有些患者T细胞数增加,最终可达正常水平[10]。

3 联合免疫缺陷病

联合免疫缺陷病(combined immunodeficiency disease, CID)指T细胞和B细胞均缺乏或功能紊乱,由于原发性淋巴细胞发育异常或伴随其他先天性疾病而发生。重症联合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency disease, SCID)是由一组胸腺、淋巴组织发育不全及Ig缺乏的遗传性疾病,机体不能产生体液免疫和细胞免疫应答。此类疾病可以是常染色体隐性遗传或X连锁隐性遗传。

3.1 X-SCID

是最常见的性连锁遗传的SCID,占全部SCID病例的50%~60%。患者病理表现为T细胞缺乏或显著减少;B细胞数量正常但功能异常,导致Ig生成减少和类型转换障碍;B细胞表面可表达pre-B细胞的特异性标志p120抗原,表明B细胞也存在成熟障碍。IL-2Rγ链基因突变是该病的主要发病机制。FCM应用CD132抗体检测外周血来源的单个核细胞表面γ 链的表达,发现X-SCID患者γ链表达为阴性[16]。同时,FCM也可检测到X-SCID的患儿其单核细胞中γc表达缺乏[17]。

3.2 腺苷酸脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)缺陷病

ADA基因定位于第20对染色体(20q13-ter),该基因突变或缺失可致ADA缺乏,致使腺苷、脱氧腺苷、dATP在细胞内聚积。患者主要表现为T细胞和B细胞受损,并出现严重感染。对洗涤过的红细胞中dATP浓度和ADA活性的分析可作出明确判断。Otsu等[17]用FCM分析了ADA缺陷患者外周血单个核细胞内ADA的水平,发现ADA严重减少甚至缺失。

3.3 MHCⅡ类分子表达缺陷病

此症又称为裸淋巴细胞综合征( bare lymphocyte syndrome,BLS),是一种罕见的原发性严重免疫缺陷病。患者MHCⅡ类基因正常,但由于表达调控异常,导致机体所有组织细胞均不表达MHCⅡ类分子,胞内也无MHCⅡ类分子mRNA。用FCM测患者外周血,结果显示B细胞和T细胞数正常[16],CD4+T细胞数量减少。残留的CD4+细胞表达CD45RA,提示该细胞处于未激活状态。B细胞表达高水平的IgM和IgD,但不表达MHCⅡ类分子HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DM[16]。

4 吞噬细胞功能缺陷病

原发性吞噬细胞缺陷包括吞噬细胞数量异常、吞噬细胞移动和(或)黏附功能异常、吞噬细胞杀菌活性异常、单核/巨噬细胞功能异常。

4.1 慢性肉芽肿病(chronic granulomatous disease, CGD)

CGD表现为吞噬细胞杀伤功能缺陷。其发病机制是gp91phox B缺乏。70% CGD为XCGD,是编码β亚单位的CYBB基因突变引起[18]。患者表现为反复发作的细菌和真菌感染。FCM通过间接检测激光敏感染料氧化后荧光的增强,检测中性粒细胞产生氧化爆发的能力[19]。CGD患者则不能产生增强的荧光。

4.2 白细胞黏附功能缺陷(leukocyte adhesion deficiencies,LAD)

LDA-1的发病机制是编码CD18的基因突变,导致CD11/CD18(β2整合素)家族蛋白表达降低。患者表现有反复发作的无脓感染和婴儿脐带脱落延迟。LAD-2的发病机制是岩藻糖代谢缺陷,导致sialyl lewis X (CD15s)缺失,患者表现有反复发作的感染。FCM对诊断2种LAD均非常有用,对粒细胞设门,结果发现患者CD11和CD18分子的表达水平降低或消失[10],LAD-2患者CD15s表达减少或缺失。

5 补体缺陷病(complement deficiency)

多数补体缺陷属常染色体隐性遗传,在补体调节因子中,以C1INH缺陷最为常见,患者表现为反复发作的局部皮肤、黏膜水肿。FCM应用价值不大。B细胞和T细胞亚群通常是正常的。

FCM不仅已普遍应用于临床医学和基础医学研究领域,还可以通过定量流式细胞分析,精确定量分析细胞功能的微小变化,对于监测艾滋病等传染病有着重要的意义和发展潜力。FCM进行免疫表型分析已成为PID诊断的重要条件,还可用于一些PID的病情判断和疗效观察。随着对PID发病机理的深入了解以及新抗原和新抗体的发现和确定,在不久的将来,FCM诊断实验将发挥更大的作用。

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