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综述:间充质干细胞在急性肺损伤中的应用进展
Development on Application of Mesenchymal Stem Cells in Acute Lung Injury
隆玄 吴晓丹 施劲东 李善群
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作者单位:复旦大学附属中山医院呼吸科
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间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)起源于中胚层发育早期,主要存在于全身结缔组织器官间质中, 以骨髓组织中含量最为丰富。其具有自我更新、多向分化以及免疫调节等功能,属于造血干细胞以外的另一类成体干细胞。自急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)于1967年被首次报道以来,急性肺损伤(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ ARDS)引起了广泛关注,大量研究致力于阐述其发生发展机制以及探究更佳治疗方法。然而,鉴于其发病机制的复杂性以及病情易发生急骤变化,目前还未能完全阐明其发生机理,治疗上也未取得重大突破[1-2]。目前认为,由各种炎症细胞及炎症因子等因素介导的炎症失衡、氧化应激及凋亡引起的损伤在ALI/ ARDS中起重要作用。鉴于MSCs的再生修复、抗炎、免疫调节及抗氧化应激功能,使MSCs治疗急性肺损伤在理论上具有可行性,并在有关研究中得到证实,然而,其具体治疗机制仍不明,因此已成为目前研究的热点。

1 间充质干细胞概述

1.1 来源、分化、主要特征

间充质干细胞最早由Friedenstein等于1968年报道,其描述了骨髓来源的一群能贴壁生长、纺锤梭形的、具有多分化潜能的基质细胞,后来被Caplan称做间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。多种组织可分离出MSCs,如骨髓、脂肪组织、骨骼肌、滑膜、脾脏、脐带血、羊水等,以骨髓中含量最多。根据国际细胞治疗学会[3]的标准,MSCs的确定需符合下列条件:(1)能贴壁生长;(2)有特异的表面抗原表达,如95%以上必须表达CD90、CD105、CD73,且CD34、CD45、CD19 或CD79α、CD14 或CD11b、HLA -DR 为阴性;(3)具有多向分化潜能,能向骨、软骨、脂肪细胞等分化。MSCs具有干细胞的2个基本特征,即自我更新与多系统分化潜能,分化为各种结缔组织及其他组织的潜能,包括脂肪组织、骨髓基质、软骨组织、骨组织与肌腱等。MSCs细胞表面表达中等水平MHC-I类分子,但不表达MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子,如CD80、CD86、CD40和B7-1、B7-2等,因此具有低免疫原性。

1.2 主要功能

1.2.1 诱导分化、再生、修复功能 MSCs在组织损伤时可迁徙至损伤部位,分化为损伤组织细胞,参与损伤组织的再生修复。Rojas等[4]通过体内和体外研究表明,骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMDMSCs)对博来霉素诱导的小鼠肺损伤有保护作用,这种作用与BMDMSCs迁移、定植到受损肺,增殖分化为肺组织细胞并表达肺组织细胞特异表型有一定关系。在对四氯化碳(CCl4)诱导的肝损伤及肝纤维化模型大鼠的研究中也证实,人骨髓源性间充质干细胞(hBMDMSCs)能够改善损伤肝的修复,在移植1 d后,hBMDMSCs就能定植于肝门、肝小叶结构,部分能整合于肝实质中,肝纤维化的改善程度与肝组织内移植的MSCs的数量有关。

1.2.2 抗炎与免疫调节功能 随着对MSCs研究的不断深入,有越来越多的研究表明MSCs不仅具有多分化潜能特征,还能作为一种免疫调节细胞,分泌各种细胞因子、趋化因子、免疫递质等细胞活性因子,抑制T细胞、B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)等免疫细胞的增殖、表型及分化。

1.2.2.1 体外研究 Aggarwal等[5]研究结果表明,MSCs能下调重要炎性因子干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达,增加抗炎因子白细胞介素10(IL-10)的表达水平,通过下调树突状细胞(DC)分泌TNF-α,使其激活T淋巴细胞的能力降低,同时由于其减少IFN-γ及增加IL-4的分泌,促使T细胞由Th-1向Th-2转变,最终使炎性反应转为抗炎反应。Corcione等[6]发现, MSCs通过上调细胞周期抑制性蛋白p27 kip1及下调细胞周期蛋白D2(cyclin D2),使细胞滞留于G0 /G1期,而并非诱导细胞凋亡来抑制B细胞及T细胞的增殖。MSCs还可能通过组织生长因子β1(TGF-β1)、前列腺素E-2(PGE2)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)等可溶性细胞因子来抑制B细胞增殖及减少B细胞IgG、IgM、IgA的分泌和下调表面趋化因子受体,如CXCR4、CXCR5、CR7等的表达,从而抑制B细胞活性。Spaggiari等[7]研究结果表明,MSCs不仅能强烈抑制白细胞介素2(IL-2)诱导的NK细胞增殖,还能降低NK细胞的细胞毒性及分泌活性,机制可能与NK细胞表面激活受体(如NKp30、NKp44、NKG2D)的表达下调有关,而IDO与PGE2在其中起着重要的调节作用。Sato等[8]的研究结果也表明,MSCs产生一氧化氮(NO)是抑制T细胞增殖的主要机制之一。在此过程中,MSCs表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)增加,T细胞信号转导及转录活化子5(signal transducer and activator of transcription 5,Stat5)的磷酸化途径被抑制可能为重要机制之一。

1.2.2.2 体内研究 MSCs的这种免疫调节功能在许多体内实验也得到了很好的证实,为治疗炎症及免疫性疾病提供了新思路。在大鼠爆发性肝衰竭模型中,MSCs溶解产物及MSCs条件培养基能显著降低损伤动物的肝坏死标记物(如ALT、AST等)的浓度,抑制肝小叶炎症细胞浸润、胆管细胞增生及肝细胞死亡。Augello等[9]报道,腹膜内注射BMDMSCs能减轻Ⅱ型胶原蛋白诱导的小鼠骨及关节损伤,降低风湿性关节炎小鼠血TNF-α水平。然而,与此相反,Djouad等[10]的研究结果表明MSCs并不能保护胶原蛋白所致的小鼠风湿性关节炎,这种区别可能与实验设计、干预的时间点及干预途径有关,还需要更多研究进一步探讨。

1.2.3 抗氧化应激与抗凋亡作用 细胞凋亡与氧化应激状态在炎性损伤的发生发展中起着重要作用,其特点主要是活性氧、活性氮族的水平增高,如过氧化氢(H2O2)、过氧阴离子(O2 -)、一氧化氮(NO)等的增高及凋亡相关蛋白表达增加。已有较多研究表明,MSCs具有抗氧化应激、抗凋亡的能力,对机体氧化还原状态的平衡有一定的作用。Lanza等[11]首次在小鼠实验性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE,该模型是人类多系统硬化症的动物模型)的研究中证实,静脉注射BMDMSCs能显著抑制由EAE介导的中枢神经系统金属硫蛋白的活性,通过影响超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽-S-转移酶等介导氧自由基的清除而保护损伤鼠的脑组织,同时也能下调凋亡相关蛋白聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose) polymerase-1,PARP-1]、p53的水平;在体外实验也证明了MSCs能对氧化应激条件下的神经细胞有保护作用。我国学者Liu[12]等用MSCs条件培养液治疗慢性酒精性神经损伤的研究结果表明MSCs能减少酒精所致的细胞凋亡,改善细胞的氧化应激状态,推测这与磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路被抑制、细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路的持续激活有关。

2 急性肺损伤概述

2.1 ALI/ARDS诊断

目前对于ALI/ARDS尚无病原学、影像学以及实验室检查的诊断学“金标准”。根据1994年欧美联合会议(the American-European Consensus Conference Committee)发表的ALI/ARDS的新定义标准,认为ALI/ARDS需满足以下几个基本条件[1]:(1)急性发生的过程;(2)影像学表现为双肺浸润性病变;(3)肺动脉楔压(pulmonary-artery wedge pressure,PAWP)小于18 mmHg或排除心源性因素引起的左肺动脉高压;(4)氧合指数低于300 mmHg,而进一步发展到氧合指数低于200 mmHg时,认为已经发展到ARDS阶段。

2.2 ALI/ARDS患病率

由于缺乏诊断的“金标准”,以及对ALI/ARDS的流行病学研究极其困难,再加上研究方法与研究对象的不同等因素,使得ALI/ARDS的患病率的研究结果有不同程度的区别,报道的ALI/ARDS患病率介于1.5~78/10万[2],近年来由于保护性机械通气及临床药物治疗的进步,ALI/ARDS的患病率有所下降。

2.3 ALI/ARDS主要发生机制

ALI/ARDS发生机制主要是在各种直接或间接作用下引起的,由中性粒细胞、肺血管内皮细胞、肺泡上皮细胞及巨噬细胞、单核细胞、血小板及凝血纤溶系统等参与,最终使肺泡-毛细血管基底膜渗透性增高、肺间质水肿、蛋白渗出,从而导致肺充血、水肿、及部分肺不张等损伤的过程。其中涉及到蛋白激酶、核因子κB(NF-κB)等转录因子的激活,炎性因子、趋化因子、活性氧化物、蛋白酶等物质的释放,肺泡表面活性物质的生成减少及失活、细胞凋亡等,其中由中性粒细胞等炎症细胞及其产生的炎症介质(如TNF-α、IL-1、IL-8、IL-6等)释放增多,抗炎因子(如IL-10、IL-4)等释放减少所致的肺部炎症平衡失调,是ALI/ARDS发生、发展的重要因素。

3 间充质干细胞在急性肺损伤应用的进展

3.1 MSCs的再生修复在肺损伤的应用

MSCs的多向分化潜能,使其在肺部的再生修复作用得到广泛关注,MSCs对肺损伤干预的早期研究主要集中在该方面。Yamada等[13]探讨内毒素诱导的小鼠急性肺损伤时发现,MSCs移植后能定植于损伤的肺组织局部,分别表达CD34和细胞角蛋白,减轻肺部组织结构破坏和气肿样改变。Rojas等[4]报道在博来霉素诱导的肺损伤小鼠模型中,MSCs移植后在损伤的肺组织中存活,并分化为肺细胞的表型,减轻了肺损伤程度和纤维化。但也有一些研究者对此产生质疑, Kotton等[14]在对博来霉素诱导的肺损伤的研究中,使用了一种肺上皮细胞系-特异性报告系统来除外自体荧光、死细胞和杂质血细胞,结果并未发现任何由移植骨髓分化的肺泡上皮细胞。Chang等[15]发现用传统的显微镜观察,肺内一些细胞同时表达MSCs和肺泡上皮标志物,而换用重叠显微镜观察后,发现它们并非同一个细胞,而是由于细胞影像的重叠造成的假象。

3.2 MSCs的免疫调节在ALI/ARDS的应用

随着MSCs免疫调节在基础研究方面的进展,其应用于ALI/ARDS的研究也愈加深入。对气管内滴注大肠杆菌内毒素所致小鼠ALI的研究中,Gupta等[16]发现气管内给予MSCs能够增加肺损伤小鼠的生存率,并降低小鼠肺泡灌洗液(BALF)炎性因子MIP-2和TNF-α浓度,升高BALF及血浆中抗炎因子IL-10的水平,改善小鼠肺损伤。Ortiz等[17]报道MSCs能保护博来霉素诱导的小鼠肺部炎性损伤,MSCs分泌IL-1受体拮抗剂(IL1RN)是介导此作用的重要因子之一,IL1RN通过抑制巨噬细胞释放TNF-α及阻止IL-1α依赖性的T细胞增殖而发挥抗炎作用,而TNF-α与IL-1是介导ALI/ARDS的最主要的炎性因子。Xu等[18]在对腹膜内注射内毒素所致小鼠急性肺损伤模型的研究中,证实静脉注射BMDMSCs能改善小鼠肺损伤组织的局部及全身炎性反应,减轻肺水肿,这一作用并不依赖MSCs分化功能,而与MSCs在损伤肺的作用下迁移至肺组织并抑制肺部炎性因子的产生,使体内炎性反应向抗炎反应转化有关。之后他们又将损伤肺组织细胞与MSCs体外共培养,也验证了这一发现。然而,最近也有研究发现了MSCs在外界环境的作用下能够表现出免疫抑制与增强的双重性质,给之前所认为的MSCs的抗免疫作用提出了质疑与挑战。有研究[19]在低水平的炎症刺激下,如IFN-γ,MSCs能表达MHCⅡ类分子,并作为抗原提呈细胞刺激体内免疫反应。用IFN-γ刺激的MSCs免疫小鼠,在小鼠体内能产生CD8+细胞毒性T细胞。研究[20]发现将MSCs与脾来源的单个核细胞(MNC)或B细胞共培养,能刺激2种细胞分泌IgG增加,而将MSCs与用脂多糖(LPS)刺激后的MNC或B细胞共培养,则表现为抑制2种细胞IgG的分泌,且抑制作用与LPS刺激水平呈正相关。最近有报道[21]MSCs能抑制中性粒细胞凋亡及脱颗粒,而不影响其趋化和吞噬作用,从而可能加剧了原有的炎性反应。

3.3 MSCs的其他作用在ALI/ARDS的应用

MSCs还具有稳定肺血管内皮细胞,减少肺水肿,增加肺水肿液体转运和清除的作用。MSCs分泌角化细胞生长因子(KGF),KGF能调节肺泡上皮细胞增殖以及肺泡表面活性物质基因的表达,使肺泡表面活性物质产生增加。MSCs还具有抗细胞凋亡、上调肺泡上皮细胞钠离子转运蛋白的表达,增强肺水运转的功能。此外,MSCs分泌肝细胞生长因子(HGF),HGF通过Tiam1介导的Rac及Rho GTP结合蛋白途径,减少血管内皮损伤,减轻肺血管渗出而使肺水生成减少。研究[22]表明,将人类MSCs与炎症刺激的肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)共培养,前者能分泌血管生成素-1(Ang1),Ang1通过使ATⅡ表面受体Tie2磷酸化,降低肺泡上皮渗透性,减少肺水生成;此外,Ang1还具有抗炎,下调内皮黏附分子表达,抑制白细胞黏附到血管内皮细胞的作用。

3.4 MSCs介导的基因转染在ALI/ARDS的应用

由于MSCs具有低免疫原性、在炎症损伤的刺激下能迁移至损伤部位发挥作用而不引起免疫排斥,且其来源广,易培养增殖,因此作为一种载体细胞介导基因转染,在基因治疗上具有明显优势。Mei等[23]报道Ang1基因转染的MSCs能显著降低LPS气管内滴注所致的急性肺损伤小鼠BALF的IgM及蛋白水平,几乎能完全恢复肺泡上皮渗透性。Manning等[24]在对大鼠肺缺血再灌注损伤的研究中发现,病毒型IL-10(vIL-10)修饰的MSCs能显著降低肺泡灌洗液CD4+与CD8+T细胞数量,减轻肺内皮细胞通透性,抑制细胞凋亡,从而明显改善肺损伤。

4 挑战与展望

尽管MSCs在许多疾病模型的体内及体外研究中都取得可喜的成果,但也存在着一些问题、争议和挑战,在ALI/ARDS患者的临床应用中仍需要更多的研究作进一步探讨。首先,由于MSCs目前尚无特异性的表面分子标记,缺乏明确的鉴定标准及取材来源、培养条件的差异和培养传代次数的不同是否会引起MSCs的性质、功能的不同,需要进行探讨。其次,MSCs治疗ALI/ARDS的机制尚存在争议,还有待进一步阐明。而且MSCs具有自我更新与多分化潜能,其应用于人体内是否会产生致瘤性,需要慎重对待,有研究[25]表明,尽管在体内尚未发现MSCs的致瘤性,但在体外经过多次反复传代后,MSCs能异常分化,出现恶变。将MSCs与乳腺癌细胞混合后种植于皮下,也发现MSCs增强了乳腺癌细胞的转移能力[26]。再次,MSCs治疗ALI/ARDS的剂量、时间点、干预方式还需要进一步摸索,以探求最佳的干预模式。此外,如果应用于临床,何种患者、何种病情能采用MSCs治疗,也需要我们致力研究。目前MSC应用于ALI/ARDS的治疗的研究已成为一个热点领域,初步的研究也已证实了其治疗ALI/ARDS的有效性,尤其是其介导的基因治疗,更是有着诱人的应用前景。因此,需要有更多研究进一步探讨MSCs在ALI/ARDS的应用,最终为临床治疗ALI/ARDS提供一个更为有效的手段。

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